打开文本图片集
摘要[目的]研究小家鼠3个群体间Sry基因序列。[方法]对来自临沂、漠河、云梦的33只雄性小家鼠个体进行基因组DNA提取，设计引物，对其Sry基因进行扩增和序列测定，并使用分子处理软件定义单倍型，分析碱基组成，构建系统发育树。[结果]33个样品全部测序成功，经过数据分析后得到以下结果：33个样品的Sry基因片段大小均在856 bp左右。对33个序列对比分析，共定义了7个单倍型，Sry基因碱基的平均含量分别为A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，不同个体之间碱基无明显差异，遗传距离小。以大家鼠（KC215142）为外群，小家鼠（AF068054）为参照序列构建系统发育树，7个单倍型与小家鼠共处同一分支。[结论]南北群体的小家鼠Sry基因无明显差异，基因突变率极低，具有极强的保守性。
关键词小家鼠；Sry基因；序列分析
中图分类号Q953文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0114-03
Abstract[Objective]To study the sequence of Sry gene of Mus musculus from three groups. [Method]We extracted the whole DNA genome of 33 mice came from Linyi， Mohe， Yunmeng Region，then used the primer to amplify the Sry genes and determined DNA sequence of the 33 mice individually. To define haplotype， analyze base composition， construct phylogenetic tree by using a series of molecular processing software. [Result]The sequence of the 33 mice’s DNA genome was conducted successfully， the lengths of DNA genome of 33 mice were all about 856 bp. 7 haplotypes were defined by the comparative analysis of 33 sequences. The average content of the four bases（ATGC） was measured respectively： A 27.5%，T 30.7%， G 22.5%， C 19.3%. There was no significant difference between the individual mouse， and the genetic distance was small. Using Rattus norvegicus（KC215142） as outgroup and M.m. musculus （AF068054） as reference sequence to construct phylogenetic tree，7 haplotypes and Mus musculus were in the same branch.[Conclusion] There is no significant difference between the north and south of the Mus musculus Sry gene， Sry gene mutation rate is very low， with a strong conservation.
Key wordsMus musculus；Sry gene；Sequence analysis
小家鼠（Mus musculus）属啮齿目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠属（Mus）[1]，是一类体型较小、夜出活动、世界性分布的家栖哺乳鼠类。小家鼠为鼠科中的小型鼠，一般体长为60～90 cm，身体较轻，尾与身体长度相当或略短于体长，头较小且吻短，耳圆形，毛色因季节和所处环境不同而有所差异，体被呈棕灰色或暗黑色或黑褐色[2-3]。随着分子生物学、遗传学等学科和技术的发展，通过线粒体DNA研究表明，小家鼠包括3个亚种，它们分别是：M.m.domesticus，分布在西欧、中东和北非地区；M.m.musculus，分布在东欧和东北亚地区；M.m.castaneus，分布在东南亚和印度次大陆[4]。小家鼠为现实验室品系小鼠的祖先，作为重要的模式物种[3]，被廣泛利用在遗传、医学、分子研究等方面，其主要有以下优势：①它是当前重要的模式物种，现在实验用小鼠的全基因组序列已经完成，可以被广泛应用于生物学、医学等多个领域的研究；②其与人类密切的联系，使其广泛存在于各大洲，具有世界性、伴生性等特点，人类疾病往往可在它身上发现，同时它的遗传分化模式能够反映人类活动对其扩散的影响，因此能够通过小家鼠的起源与扩散去探讨人类的起源与扩散；③小家鼠遍布于世界各地，可以利用分子系统地理学的理论与方法研究其起源与扩散，从而重现历史上发生过的地理事件和气候的变迁[5-7]。
Y染色体（Y chromosome）是决定生物个体性别的一种性染色体。在雄性是异质型的性决定生物中，雄性所具有的而雌性所没有的那条性染色体叫Y染色体[8]。Y染色体多态性作为雄性小鼠的特有遗传标记，在探讨人类的迁徙方面具有重要价值。目前利用Y染色体研究我国人群的迁徙已经取得了许多重要的成果，并且已有研究证明Y染色体是研究小家鼠种群遗传学的有效分子标记[9-10]。
Y染色体上Sry基因（Sexdetermining region of the Y chromosome）对哺乳动物性别的决定起关键作用。众多研究表明，Sry基因突变引起人或其他哺乳动物性腺发育受阻。将小鼠Sry基因导入XX 雌性小鼠受精卵，可使其向雄性化转变，包括支持细胞的分化、迁移，并发育形成睾丸，这说明Sry基因是性别决定的核心基因，直接诱导精巢发育，对睾丸发育起着关键性的作用，Sry能够触发睾丸的发生，决定雄性性状[11-12]。笔者采集了临沂、漠河、云梦的33只雄性小家鼠个体进行试验，测得33个样品的Sry基因，并对样品个体定义单倍型，将其与GenBank中下载的褐家鼠（Rattus norvegicus，KC215142），M.m.musculus（AF068054）的片段进行对比分析，通过单倍型构建系统发育树来探究Sry基因的遗传意义，从而进一步探究我国小家鼠亚种的分类情况，为相关研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料33个小家鼠个体来自临沂（LY3、LY6、LY7、LY8、LY9、LY10、LY11、LY12、LY23、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48），漠河（MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56、MH62），云梦（YM6、YM39、YM53、YM56、YM59、YM69、YM72、YM78）3个群体，取其尾巴肌肉组织，用100%乙醇浸泡，保存在-80 ℃备用。
1.2方法用Promega试剂盒方法提取低温保存的小鼠尾部肌肉组织的基因组DNA，并进行电泳测纯。设计引物，对样品Sry基因进行扩增，扩增长度约为1 kb，使用扩增酶（Premix酶）进行PCR扩增，扩增结束后用凝胶电泳进行检测，检测是否扩增出基因序列，并送至上海生工生物工程服务有限公司进行基因测序。
将生工测序的DNA序列使用DNAstar软件中的Editseq和Seqman软件进行剪切处理，使用DAMBE软件定义了7个单倍型，与从GenBank中下载的M.m.musculus（AF068054）、Rattus norvegicus（KC215142）的片段进行对比分析，使用软件Mega 6.0进行比对并构建系统发育树。
2结果与分析
2.1小家鼠基因组DNA提取结果提取33个样品基因组DNA，各取1 μL，进行电泳和凝胶成像系统观察可知，33个样品基因组大小在20 000 bp以上，凝胶电泳结果显示，条带整齐明亮，样品有少许降解，在试验允许范围之内。
2.2小家鼠基因组DNA扩增 将样品基因组DNA进行PCR扩增后，取5 μL的扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，图1为部分电泳结果图。从图1可以看出，9个样品电泳结果较好，条带明亮且清晰，提纯结果较好，扩增比较成功。
2.3单倍型组成使用软件DAMBE定义3个群体33个样品的单倍型，共定义了7个单倍型，Y1：LY7；Y2：LY10、MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56；Y3：MH62；Y4：YM53；Y5：LY11、LY12、LY23、LY3、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48、LY6、LY8、LY9、YM39、YM56、YM59、YM6、YM69；Y6：YM72；Y7：YM78。
2.4单倍型的碱基含量組成使用Mega 6.0对单倍型中的序列进行碱基含量分析，结果表明Sry基因中A、T、G、C的平均含量分别为A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，样品间碱基组成几乎无差别（表1）。
2.5遗传距离将7个单倍型Sry基因序列与小家鼠和大家鼠的Sry序列进行比较，用Mega 6.0制作7个单倍型的遗传距离（表2）。由表2可知，7个单倍型的遗传距离十分小，
说明7个样本的序列非常近，该基因突变几率很低。根据以往研究可知，小家鼠的线粒体基因遗传分为南北两大分支，此次试验中所用到的样品为漠河、临沂、云梦3个群体，在遗传距离上未体现出南北差异，说明南北群体小家鼠的Sry基因无明显差异，小家鼠与大家鼠之间存在较小的遗传距离。
2.6系统发育树由图2可知，以大家鼠（KC215142）为外群，小家鼠（AF068054）为参照序列构建系统发育树，7个单倍型样本构建的系统进化树分为2个大的分支，其中7个单倍型与M.m.musculus（AF068054）共处同一分支，与Rattus norvegicus（KC215142）不在同一分支上，存在较小差异，这也与遗传距离所得信息一致。
3结论与讨论
小家鼠是一种与人类伴生的共栖物种，作为模式物种，被广泛利用于医学和生物学等领域。该试验采用新鲜冷冻肌肉组织为材料提取DNA，用特异性引物对Sry基因进行扩增，扩增结果经过电泳、测序等操作后，得到33个样品小家鼠Sry基因序列信息。经过数据分析后得到以下结果：样本Sry序列大小均在856 bp左右。对33个序列对比分析，共定义了7个单倍型，Sry基因碱基的平均含量分别为A 275%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，这些样品之间的碱基差别极小，序列无明显差异。以大家鼠（KC215142）为外群，以小家鼠（AF068054）为参照序列构建系统发育树，7个单倍型与小家鼠共处同一分支，说明南北群体的小家鼠Sry基因无明显差异，基因突变率极低，具有极强的保守性。以上结果显示，Sry基因遗传较为保守，但由于所用样品数量有限，为获得更详尽的试验结果和数据，应进一步扩大采样的数量和范围，以更深入地研究其遗传特点。
参考文献
[1] 王延正，许文贤.陕西啮齿动物志[M].西安：陕西师范大学出版社，1992：93-155.
[2] 徐华，靖美东，黄玲，等.新疆小家鼠控制区序列分析[J].安徽农业科学，2010，38（1）：82-84.
[3] 李菁菁，张亚平.小家鼠的遗传与进化研究进展[J].动物学研究，2001，22（5）：406-412.
[4] PRAGER E M，SAGE R D，GYLLENSTEN U，et al.Mitochondrial DNA sequence diversity and the colonization of Scandinavia by house mice from East Holstein[J].Biol J Linn Soc，1993，50（2）：85-122.
[5] BOURSOT P，AUFFRAY J C，BRITTONDAVIDIAN J，et al.The evolution of house mice[J].Ann Rev Ecol Syst，1993，24：119-152.
[6] POCOCK M J O，HAUFFE H C，SEARLE J B.Dispersal in house mice[J].Biol J of the Linn Soc，2005，84（3）：565-583.
[7] SAGE R D，ATCHLEY W R，CAPANNA E.House mice as models in systematic biology[J].Syst Biol，1993，42（2）：523-561.
[8] 柯越海，宿兵，肖君华，等.Y染色体单倍型在中国汉族人群中的多态性分布与中国人群的起源及迁移[J].中国科学（C辑），2000，30（6）：614-620.
[9] 孟祥宁，薛雅丽.利用Y染色体进行人类起源和进化分析[J].国外医学（遗传学分册），2003，26（2）：63-66.
[10] 杨仙荣，王美琴，李少华.人类Y染色体的演化[J].遗传，2014，36（9）：849-856.
[11] 郭亚平，贺艳萍，张红梅，等.SRY基因及其性别决定[J].动物学报，2001，47（S1）：241-246.
[12] 李秀蓉，李麓芸，卢光琇.Sry基因的研究进展`[J].生命科学研究，2001，5（1）：25-28.
