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摘要：以湖北荆州地区疑似猪链球菌病的病猪为研究对象，经病料采集、细菌分离培养、纯化、染色、镜检、生化鉴定、血清学试验和PCR检测，确定该病猪为猪链球菌2型病例。经药敏试验筛选出了环丙沙星、阿莫西林和头孢唑肟钠为其敏感药物；经动物攻毒试验复制出同样疾病，表明猪链球菌2型对湖北地区猪具有很强的致病性。
关键词：猪链球菌；鉴定；生物学特性
中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2722-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.031
Abstract： In this study， the suspected swine of Streptococcus suis disease in a certain pig farm in Jingzhou， Hubei Province was used as the research object. The results were as follows： disease collection， bacterial culture， purification， dyeing， microscopic examination， biochemical identification， serological test and PCR. The swine were determined as Streptococcus suis type 2 cases. Ciprofloxacin， amoxcillin and ceftizoxime sodium were screened by drug sensitivity test，and the same disease was reproduced by animal challenge test， indicating that Streptococcus suis type 2 had a strong pathogenicity to pigs in Hubei area. This experiment is very important for the prevention and control of Streptococcus suis disease in Hubei pig industry.
Key words： Streptococcus suis； identification； biological characteristic
豬链球菌病是由猪链球菌引起的一种人畜共患传染病，可感染人致死。而猪链球菌2型是猪链球菌中致病性最强的一种，其毒力可能与溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外蛋白因子（EF）和溶血素（SLY）等毒力因子有关。该病多在4～12周龄猪群中暴发，无明显的季节性，全年均有发生，发病率和死亡率都很高[1]。病猪表现为脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、浆膜炎等，并可导致母猪流产和局部脓肿。目前，已发现猪链球菌共有35个血清型，毒力最强的依次为2型、1型、9型和7型，目前感染人的主要是2型。
猪链球菌2型与猪的临床疾病有一定的相关性，不是所有的2型菌株均能致病，也并非引起同一种疾病。各龄的猪均能感染猪链球菌，但大多在3～12周龄的仔猪先发流行，尤其在断奶及混群时出现发病高峰[2]。口、鼻腔是主要的入侵组织，然后在扁桃体定居繁殖。在关节炎的病例中，最早见到的变化是滑膜血管的扩张和充血，关节表面可能出现纤维蛋白性多发浆膜炎，受影响的关节囊壁可能增厚，滑膜形成红斑，滑液量增加，并含有炎性细胞。猪链球菌2型引起病猪患支气管肺炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、动脉炎、脓肿。MRP和EF被认为是猪链球菌的两种重要毒力因子，从病猪体内分离的菌株含两种分子，而从大多健康猪体内分离的菌株没有这两种大分子。根据MRP及其相关蛋白存在与否，猪链球菌2型存在以下几种表现型：MRP+EF+、MRP-EF-、MRP+EF*（EF类似物）、MRP+EF-、MRP+EF-、MRP-EF+、MRP-EF+等[3，4]。
诊断猪链球菌感染是根据临床症状和病理变化，证实感染需通过病原分离和组织检查才能确定。目前，检测方法主要有分离培养及生化鉴定、血清学鉴定、分子水平鉴定、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）方法[5]。根据细菌形态可初步鉴定猪链球菌，但要确定其血清型比较困难，可用分型诊断血清进行乳胶或玻片凝集试验PCR检测[6，7]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 标准血清 猪链球菌2型标准血清，由长江大学动物科学学院实验室制备。
1.1.2 试验试剂 生化发酵管、药敏试纸：购自杭州天和微生物试剂有限公司；染色液：长江大学动物科学学院实验室配制；TSA、TSB：购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.3 试验动物 试验病猪：来源于湖北枝江某猪场。复制试验昆明鼠：购自长江大学医学院实验动物中心，体重20～25 g。复制试验仔猪：湖北恩施某猪场，50日龄猪健康仔猪，猪链球菌2型抗体检测为阴性。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌分离、纯化 用小负压穿刺术采集疑似猪链球菌病猪的关节液，接种TSA培养基，37 ℃培养24 h；挑取平板培养基上生长的单个可疑菌落进行革兰氏染色镜检，选择镜检为G+双球菌或短链状球菌的菌落再次培养以纯化。挑选纯化培养的单个可疑菌落先作标记，然后挑取少许菌落按常规革兰氏染色法进行染色，油镜下观察染色结果。
1.2.2 形态观察 将纯化培养的细菌接种于绵羊血琼脂平板和TSA培养基，恒温37 ℃培养18～24 h，进行细菌涂片、革兰氏染色、镜检，观察其在绵羊血琼脂平板和液体培养基中的生长特性和细菌形态。
1.2.3 生化鉴定 取纯化培养后的典型菌落分别接种葡萄糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、蕈糖、6.5%NaCl、水杨苷、马尿酸盐、七叶苷、V-P等，37 ℃培养24 h，并记录试验结果。
1.2.4 血清定型 病原菌抗原的制备：取纯化后的冻干菌种，接种于TSA培养基，37 ℃培养12 h，纯度检验合格后，作为一级菌种，2～8 ℃保存，不超过7 d。挑取一级菌种中的单菌落，接种于TSA培养基，37 ℃培养12 h，用PBS溶液（pH 7.4）收获菌液。按菌液总量的0.8%加入甲醛溶液，37 ℃灭活24 h，每隔4 h摇动1次。该菌液作为被检抗原。
血清凝集试验：在洁净的玻片上滴上制备好的被检抗原1～2滴，然后分别滴加A～G的2型标准血清1～2滴，充分混匀，涂成大小为1.5 cm的圆圈，轻轻摇动玻片，2 min内观察结果有无凝集，有明显凝集物呈“++”以上者判为阳性。
1.2.5 毒力因子的检测 根据GenBank发表的序列，分别设计了猪链球菌2型3个毒力因子溶菌酶释放蛋白MRP、细胞外蛋白因子EF和溶血素的特异性引物见表1，进行主要毒力检测。
1.2.6 耐药性检测 挑取TSA培养基上生长的纯培养菌落和标准质控菌株，接种于2 mL营养肉汤，培养16～18 h（濃度达到1.5×108 CFU/mL），观察细菌生长情况。用无菌镊子夹取药敏试验试纸贴于TSA培养基上。37 ℃培养24 h，用最小刻度为mm的直尺测量各抗菌药物对每株细菌抑菌圈的大小，计算平均直径，根据表2判断结果。
1.2.7 动物试验 菌液制备：将纯种菌株接种于普通营养肉汤里，37 ℃培养18 h，菌液先用比浊法粗略记数，然后倍比稀释，以平板表面涂布法记数 （CFU/mL），然后将菌液稀释至1.8×109 CFU/mL，在4 ℃冰箱中保存备用。
菌液感染小白鼠试验：健康的小鼠腹腔注射菌液，每组注射4只，0.5 mL/只，对照组4只小鼠腹腔注射灭菌普通肉汤，0.5 mL/只，对注射后的小鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡的小鼠立即解剖，观察病理变化。同时对主要组织器官及血液进行病菌分离。
菌液感染仔猪试验：健康仔猪静脉注射菌液，5 mL/只，对注射后的猪隔离饲养，观察体温及其他临床表现。对死亡的仔猪立即进行解剖，观察病理变化，并对主要组织器官及血液进行分离病菌。
2 结果与分析
2.1 病菌的形态及培养特性
试验分离的菌株为革兰氏阳性球菌。固体培养物以双球菌为主，少数为3～5个排列的短链，绵羊血琼脂平板培养物可见α溶血。在TSA培养基上分离菌株的菌落均为圆形微凸，表面光滑，湿润，边缘整齐，半透明样。
2.2 生化试验结果
试验分离到的菌株接种于葡萄糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、蕈糖、6.5%NaCl、水杨苷、马尿酸盐、七叶苷、V-P等观察其生化特性。分离菌株的生化试验结果见表3。
2.3 血清学试验结果
试验分离培养的菌株与猪链球菌2型标准血清发生凝集反应。
2.4 毒力因子PCR检测结果
病菌毒力因子PCR检测结果表明毒力因子为EF基因，PCR结果如图1所示。
2.5 耐药性检测
试验分离菌株耐药性检测结果是环丙沙星、阿莫西林、头孢唑肟钠对其敏感，而庆大霉素、链霉素、红霉素、壮观霉素和林可霉素对其表现出耐药。其结果见表4。
2.6 动物复制试验
小鼠腹腔注射后4 h后开始出现死亡，眼睑、面部水肿，伴随有共济失调、麻痹或惊厥等神经症状。死亡后剖检肺有出血点，肝脾肿大，肠系膜和胃壁有出血现象，对照组小鼠未见异常。
仔猪病初表现为精神降低，体温升高、厌食，随后表现为共济失调、震颤发抖、角弓反张、呼吸困难、走路出现摇晃，3 d后有1只病猪死亡，解剖可见全身脏器出现充血或出血现象。具体试验结果如表5所示。
3 小结与讨论
通过细菌分离、培养、生化鉴定、血清学试验、PCR检测等试验方法进行研究的结果鉴定了病猪病原为猪链球菌2型。同时，通过药物敏感性试验筛选出环丙沙星、阿莫西林和头孢唑肟钠为其敏感药物；通过攻毒试验证明了猪链球菌2型对小白鼠和健康仔猪有很强的致病性。
病料采集为病猪的关节液，杂菌少，易于分离，比常规从肺脏和扁桃体等部位采集病料分离病菌要好得多，且结果准确些。耐药性检测可以看出，该病菌对头孢唑肟钠、环丙沙星、恩诺沙星、阿莫西林敏感性高，这些药物临床应用要晚于耐药性强的药物，如对青霉素、链霉素、庆大霉素和壮观霉素。这一点也证明了临床上不宜长期、大剂量的使用抗生素，造成病菌耐药而影响人类健康。
参考文献：
[1] 崔 立.猪链球菌2型四川株与江苏株对SPF猪的致病性[J].上海交通大学学报，2006（1）：45-69.
[2] 倪宏波.长春地区猪链球菌的分离与鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2002（1）：264-268.
[3] 李 春，张 东，李金海，等.四川省猪链球菌的分离与鉴定[J].四川畜牧兽医，2005（9）：25-26.
[4] 何孔旺，倪艳秀，王继春，等.猪链球菌2型的分子流行病学研究田[J].中国人兽共患病杂志，2002，18（5）：45-47.
[5] 张秀亮，沈琴芳，郑新添，等.猪链球菌的鉴定及其PCR分型方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医，2005（9）：86-87.
[6] 倪艳秀，何孔旺，王继春，等.猪链球菌2型的PCR快速检测[J].中国兽医学报，2002，22（5）：474-477.
[7] 胡晓抒，朱风才，汪 华，等.人-猪链球菌感染性综合症研究[J].中华预防医学志，2000，24（3）：150-152.
