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[摘要] 目的 探讨化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体的灰区范围，提高梅毒实验室检测的有效性和准确性。方法 收集解放军总医院第五医学中心2016年2月～2018年5月采用化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体，样品吸光度与临界值的比值（S/CO）为1～9（拟定灰区）的患者，以梅毒实验室逆向检测流程及免疫印迹法结果为金标准，评价化学发光法检测灰区的假阳性率。 结果 采用化学发光法检测梅毒螺旋体抗体患者25 190例，灰区患者462例（1.83%）。其中S/CO值1～3患者234例，假阳性率为0.74%;S/CO值>3～6患者109例，假阳性率0.27%;S/CO值>6～9患者119例，假阳性率0.12%，三组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。选取假阳性率较低的S/CO值>6～9组患者比较，S/CO值>6～7时假阳性率为0.072%，S/CO值>7～8时假阳性率为0.024%，S/CO值>8～9时假阳性率为0.020%，三组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体，在拟定灰区范围内，假阳性率随S/CO值升高呈现降低趋势。灰区范围宜设定为S/CO值1～7。
[關键词] 化学发光法;梅毒螺旋体抗体;灰区;假阳性率
[中图分类号] R514 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0151-04
Analysis of grey area of Treponema pallidum specific antibody detection
ZHAO Jing BIAN Chengrong LI Boan WANG Han
Clinical Laboratory Medical Center， the Fifth Medical Center， General Hospital of PLA， Military Clinical Laboratory Diagnostic Center for Infectious Diseases， Beijing 100039， China
[Abstract] Objective To investigate the grey area of Treponema pallidum specific antibody detected by chemiluminescent immunoassay， and improve the validity and accuracy of syphilis laboratory diagnosis. Methods The patients with cut-off （S/CO） value 1 to 9 （assumed grey area） of Treponema pallidum specific antibody detected by chemiluminescent immunoassay from February 2016 to May 2018 were collected from the Fifth Medical Center in General Hospital of PLA. The false positive rate of chemiluminescent immunoassay in grey area was evaluated by using the methods of reverse detection process of syphilis laboratory and the results of immunoblotting as gold standard. Results A total of 25 190 cases were detected by chemiluminescent immunoassay， and 462 cases （1.83%） were observed within grey area. The false positive rate was 0.74% in 234 cases with S/CO values ranging from 1 to 3， 0.27% in 109 patients with S/CO values ranging from greater than 3 to 6， and 0.12% in 119 patients with S/CO values ranging from greater than 6 to 9. There was a significant difference among three groups （P < 0.05）. Comparison of S/CO values in greater than 6 to 9 patients with lower false positive rate， the false positive rate of S/CO value greater than 6 to 7 was 0.072%， the false positive rate of S/CO value greater than 7 to 8 was 0.024%， the false positive rate of S/CO value greater than 8 to 9 was 0.020%， and the difference between three groups was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion In the assumed grey area， when the specific antibody of Treponema pallidum is detected by chemiluminescent immunoassay， the false positive rate showes a decreasing trend with the increase of S/CO value. The gray area should be set to S/CO value of 1 to 7.
[Key words] Chemiluminescent immunoassay; Treponema pallidum specific antibody; Grey area; False positive rate
梅毒是一种由密螺旋体属苍白螺旋体（Treponema pallidum，TP）感染所引起的慢性传染性疾病。在我国增长迅速，其中一级梅毒和二级梅毒均呈上升趋势[1]。2017年全国法定传染病疫情概况显示，梅毒发病率居于乙类传染病前三位。早期、准确的梅毒实验室诊断对于有效治疗具有重要意义[2]，目前体外人工培养梅毒螺旋体尚未成功[3]。梅毒实验室检测主要依赖血清学检测，包括酶联免疫吸附试验、梅毒甲苯胺红不加热血清凝集试验、梅毒螺旋体颗粒凝集试验和免疫印迹法（Western blot，WB）等。梅毒螺旋体抗体检测存在一定的假性结果[4]。近年来，化学发光法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）广泛应用于梅毒螺旋体特异性抗体的检测，具有自动化高、通量大、职业危害少等优点，但在检测过程中存在一定假阳性率，给临床诊断带来了困扰。“灰区”指在测定中处于临界值（cut-off值）附近临床意义可疑的一部分结果[5]。目前国内对CMIA检测梅毒特异性抗体的灰区范围定义模糊，缺少大样本量研究。美国疾病预防控制中心建议实验室诊断执行逆向检测流程，并以WB检测作为最终确认结果[1，6]。本研究主要探讨CMIA检测梅毒螺旋体抗体的灰区范围，提高梅毒实验室诊断的准确性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 研究对象 收集解放军总医院第五医学中心2016年2月～2018年5月，采用CMIA检测梅毒螺旋体抗体患者25 190例。Anti-TP S/CO值1～9患者共462例（1.83%），男361例，女101例，年龄0～88岁，平均（41.2±31.5）岁，其中>40～50岁组人数最多，占25.0%（116/462），其次是>50～60岁，占24.5%（表1）。中老年仍然是梅毒感染的高发人群。梅毒感染诊断符合我国制订的《中华人民共和国卫生行业标准-梅毒诊断（WS 273—2018）》[7]。
1.1.2 试剂与仪器 雅培I2000全自动化学发光分析仪及梅毒化学发光法微粒子免疫检测（CMIA）试剂购自美国雅培公司，试剂批号：91381S300;梅毒螺旋体颗粒凝集试验（treponemapallidumparticleagglutinatio-nassay，TPPA）试剂购自日本富士瑞比欧株式会社，试剂批号：AB358;血浆反应素卡片试验（rapid plasma reagin，RPR）为上海科华公司产品，试剂批号：2017041 1204。WB进行抗梅毒螺旋体抗体IgG确证实验试剂购自德国欧蒙公司，E1210320AZ。所有检测过程按照操作说明严格执行。
1.2 方法
1.2.1 梅毒实验室逆向检测流程 采用逆向检测流程法[1，6]：首先采用CMIA对疑似患者梅毒螺旋体特异性抗体进行初筛，Anti-TP S/CO值<1，报告阴性结果;Anti-TP S/CO值>9，报告阳性结果。对Anti-TP S/CO值1～9的患者，再行RPR复检。RPR阳性时，报告阳性结果;RPR阴性时，采用TPPA进行复检。对RPR与TPPA检测结果不一致的样本以WB确证实验结果为准。
1.2.2 梅毒實验室确证实验 对以上所有462例样本，采用WB确证实验判断最终结果。结果判读如下：当印迹膜上出现1条及以上相对分子质量为47 000、45 000、17 000或15 000的特异性条带时，结果判断为阳性;当无显色带或仅出现非特异条带时，结果判断为阴性。所有检测结果均以WB确证实验为金标准。
1.2.3 假阳性比率 假阳性率计算按照如下公式，即假阳性率=假阳性人数/金标准阴性人数。按照CMIA检测梅毒螺旋体特异性抗体S/CO值，划分为1～3、>3～6和>6～9之间3个区间，计算假阳性率。根据假阳性率的比较，进一步分析S/CO值在>6～7、>7～8和>8～9各区间假阳性率的分布特点。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，计数资料组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 梅毒实验室诊断
逆向检测流程结果：CMIA检测梅毒螺旋体抗体患者25 190例，Anti-TP S/CO值<1患者24 605例，报告阴性结果;Anti-TP S/CO值>9患者123例，报告阳性结果。CMIA检测灰区范围样本462例，其中181例患者确证阳性，281例确证阴性。综上，阳性患者共计304例，阴性患者24 886例，假阳性281例。总阳性率为1.21%（304/25 190），假阳性率为1.13%（281/24 886）。
2.2 CMIA检测S/CO值1～3、>3～6和>6～9区间假阳性率比较
按照CMIA检测S/CO值1～3、>3～6和>6～9三个区间划分，三组假阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2 = 78.41，P < 0.05）。见表2。
2.3 CMIA检测S/CO值在>6～7、>7～8和>8～9区间假阳性率比较
按照CMIA检测S/CO值>6～7、>7～8和>8～9三个区间划分，三组假阳性率比较差异有统计学意义（χ2 = 20.15，P < 0.05）。见表3。
3 讨论
近年来，由于术前和产前筛查的需要，以及性行为导致的梅毒发病率上升趋势等原因，梅毒的实验室检测标本量逐年增加[8]。CMIA检测梅毒抗体具有检测灵敏度高、特异性强和易于自动化的特点。本研究所用全自动化学发光免疫分析仪采用两步法检测人血清和血浆中梅毒螺旋体抗体。样品中的抗梅毒螺旋体抗体与重组抗原包被的微粒子相结合，加入抗人吖啶酯标记结合物，通过预激发液和激发液的作用，获得化学发光反应物的相对光单位。两步法可有效避免以往酶联免疫吸附试验中的钩状效应[9-10]。此外，该方法结果判定客观，人为干扰因素少，操作简单方便。有报道显示，CMIA检测各期梅毒患者梅毒螺旋体抗体的敏感性为98%[11]。
由于检测灵敏度的不断提高、患者病程以及合并症等因素影响，CMIA检测假阳性问题受到实验室的广泛关注[12]。为此，梅毒实验室的检测流程不断改进。目前主要有传统检测流程和逆向检测流程。前者首先采用非特异性梅毒试验，再进行梅毒螺旋体试验;后者先进行梅毒螺旋体抗体血清学试验初筛，初筛阳性再行非梅毒螺旋体抗原血清学复检。较前者可能受手工检测影响，后者更适于高通量自动化检测和临床诊断需求。美国疾病预防控制中心建议采用逆向检测流程。
国内专家指出，对于梅毒的实验室检测，各实验室根据检测目的、样本量、人员以及仪器设备等实际情况选择制订符合实际的检测流程，将假阴性率和假阳性率降到最低。我国学者建议，CMIA初筛阳性标本采用TPPA复检，对于TPPA阳性样本再补做RPR检测[13]。本研究首先采用逆向检测流程，对检测呈灰区范围的462例样本再行复检，总体假阳性率为1.13%，与陈兰兰等[13]的报道相符。在22例RPR阴性TPPA阳性样本，WB方法确证结果6例为阴性，而16例为阳性，因此，对于RPR与TPPA结果存在差异的患者仍需采用WB方法进一步明确诊断。RPR作为非特异性梅毒试验对于早期或者潜伏期梅毒患者检测灵敏度不高，而TPPA对一期梅毒诊断敏感性略低[14]。在一些自身免疫性疾病、风疹、传染性单核细胞增多症、回归热、恶性肿瘤、吸毒者以及反复性自然流产的患者中也会出现生物学假性检测结果[15]。此外，在本研究中，中老年仍然是梅毒感染的高发人群。有报道显示，老年人梅毒血清学检测阳性率明显提高[13]，且阳性率随年龄增大呈阶梯性升高[14-17]。
本研究通过分区间比较发现，CMIA检测S/CO值1～3、>3～6和>6～9三个区间假阳性率存在明显差异（P < 0.05）。三个区间的假阳性率随着S/CO值升高呈现逐渐降低趋势。其中S/CO值>6～9区间的假阳性率最低。进一步研究发现，在S/CO值>6～9区间中S/CO值>7～8和>8～9组假阳性率明显低于>6～7组（P < 0.05）。有文献报道阳性率>95%即可判断为阳性结果，<95%时应纳入灰区范围[18-19]。因此，采用CMIA检测梅毒螺旋体特异性抗体的灰区范围宜设定为S/CO值1～7。
前期研究采用酶联免疫加速仪有效提升了梅毒螺旋体特异性抗体检测效率[20]，本研究通过大样本量分析验证CMIA检测梅毒特异性抗体灰区范围，建议可将灰区范围缩短为S/CO值1～7，从而减少不必要的复检工作，降低实验室检测成本。本研究也存在一定不足，灰区范围验证分析在单一中心展开。由于不同实验室梅毒检测可能存在检测流程、检测技术和质量控制等差异，因此下一步我们将开展多中心临床验证，为灰区范围推广提供依据。
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（收稿日期：2019-01-22 本文编辑：李亚聪）
